原位雜交（BCIP/NBT）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

實驗流程：

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液,恒溫箱 37度雜交過夜。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9、滴加封閉液：滴加封閉血清正常兔血清。室溫30min。

10、滴加鼠抗地-高辛標(biāo)記堿性磷酸酶(anti-DIG-AP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-AP。37°C孵育40min，后TBS洗4次×5min。

11、BCIP/NBT顯色：滴加BCIP/NBT顯色液，顯微鏡觀察陽性。后純水沖洗。

12、復(fù)染細(xì)胞核：滴加核固紅染液，染核至合適程度后純水沖洗。

13、封片：自然風(fēng)干后，中性樹膠封片。

14、顯微鏡檢，圖像采集分析。

結(jié)果判讀：

陽性為藍(lán)色，藍(lán)紫色。細(xì)胞核為紅色。

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實驗，固定時間過長影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運輸；

4、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運輸。 

單據(jù)填寫：

1、探針合成：需提供待測目的基因序列或基因登錄號、所需標(biāo)記類型；

2、自帶探針需告知完整探針信息；

3、寫明檢測要求。